早在針對 SARS-CoV-2 的 mRNA 疫苗將這項技術推向舞臺中央之前，mRNA 就已被確定為是一種潛在的抗腫瘤疫苗接種方法，而現(xiàn)在，鑒于COVID-19疫苗的巨大成功，mRNA已被探索用于其它各種領域，包括針對其它傳染病的疫苗、抗腫瘤疫苗以及蛋白質補充/替代療法等。盡管mRNA對幾乎無處不在的核糖核酸酶敏感并且可能會快速降解，但其同樣具有強大的安全性優(yōu)勢，非復制意味著它不與基因組相互作用，而其相對不穩(wěn)定性和體內快速代謝清除可以通過使用各種修飾來調節(jié)?，F(xiàn)有的成功經(jīng)驗已經(jīng)證實，將mRNA制劑到不同的載體結構中后，可實現(xiàn)給藥后的快速攝取和高效蛋白質表達。
完整的 mRNA 生產(chǎn)過程面臨多方面的挑戰(zhàn)，包括與起始物料（質粒DNA，pDNA）相關的挑戰(zhàn)，以及mRNA自身的特殊屬性相關所帶來的挑戰(zhàn)，如其對幾乎無處不在的核糖核酸酶的高度敏感性、對工藝過程產(chǎn)生中的剪切的高度敏感性，以及由于mRNA與某些雜質（如雙鏈 RNA 或 dsRNA）的大小相似而導致的分離純化挑戰(zhàn)。在獲得所需目的序列的pDNA模板之后，mRNA的無細胞下游生產(chǎn)步驟可以概括為：
? 在稱為體外轉錄 (IVT) 的酶促反應過程中合成mRNA，即將目標 DNA 序列的模板 – 線性化pDNA、核苷酸 (NTP) 以及酶混合在一起。
? 然后使用層析、切向流過濾和除菌過濾等步驟，從反應混合物/污染物中得到純化轉錄 mRNA。
? 最后將 mRNA 封裝在一般由4種脂質成分組成的脂質納米顆粒（LNP）中，最終產(chǎn)品在無菌灌裝之前使用切向流過濾 (TFF) 和/或層析進行純化及濃縮。
生產(chǎn) mRNA 的挑戰(zhàn)
mRNA的合成
mRNA 的無細胞合成需要 pDNA 模板被限制酶線性化，該酶將在超螺旋質粒的特定部分進行切割。需要去除與此步驟相關的雜質，如使用切向流過濾和/或層析。然后，將線性化的 DNA 模板在體外轉錄（IVT）成 mRNA。將 RNA 聚合酶（如T7 RNA聚合酶）和三磷酸核苷酸添加到線性化且純化的 pDNA 中。為了增加 mRNA 的穩(wěn)定性和/或降低免疫原性，可以使用一些修飾的三磷酸核苷酸。當然，這種策略的商業(yè)化應用需要考慮到專利保護的問題。為了穩(wěn)定并允許在細胞中進行有效的 mRNA 轉導，需要 3' poly-(A) 尾和 5' 帽。 Poly-(A) 尾對于終止蛋白質轉錄和翻譯至關重要，它可以防止 3' 核酸外切酶消化 mRNA。 5' 帽通過防止 5' 核酸外切酶降解來穩(wěn)定 mRNA?？梢允褂脙煞N方法來給 mRNA 加帽。加帽可以發(fā)生在轉錄步驟中，或者，可以在 IVT 后，使用牛痘病毒加帽酶，以酶促方式實現(xiàn)加帽，后者通常加帽效率更高，但需要先純化 mRNA。
mRNA的純化
在 IVT 之后，轉錄的 3’poly-(A)-mRNA-5'帽產(chǎn)物需要從可能存在內毒素、免疫原性 dsRNA、殘留 DNA 模板、RNA 聚合酶、截短的 RNA 片段、未使用的三磷酸核苷酸和加帽反應過程中產(chǎn)生的其它雜質的混合物中純化。有多種選項可用于 mRNA 的純化，通常包括一或兩步的層析步驟，以及基于切向流過濾的超濾/洗濾步驟。
親和層析是常用的高效純化策略，如Poly (dT) 層析，其通過捕獲帶 poly-A 尾的 mRNA，有效去除 DNA、核苷酸、酶、緩沖液成分等不帶 poly-(A) 尾的雜質，但不能將 dsRNA 與單鏈RNA (ssRNA) 區(qū)分開來。初始親和層析之后，通常是第二個層析步驟，稱為精純步驟，以進一步純化 ssRNA，例如使用陰離子交換層析。有時，也會結合使用離子交換和疏水作用層析。
使用截留分子量范圍為 30 至 300 kDa 的切向流過濾是將 mRNA 與較小的雜質進行分離的替代性方式，使用切向流過濾也可在同一單元操作中進行濃縮和洗濾換液。
在標準批次模式 IVT 工藝中，在反應完成后從反應混合物中純化所需的 RNA 產(chǎn)物，而聚合酶、pDNA 模板和未反應的三磷酸核苷被丟棄。但由于這些 IVT 反應組分價格昂貴，已經(jīng)有開發(fā)人員嘗試使用類似補料分批的轉錄策略來進行大規(guī)模 mRNA 生產(chǎn)，過程中，監(jiān)測 IVT 反應的進程，以保持最佳反應條件，并在反應過程中，將組分按需添加到反應器中。獲得完整的全長 RNA 產(chǎn)物的效率，或出現(xiàn)截短的轉錄物的幾率，取決于 RNA 序列和反應條件的精確控制，需要優(yōu)化，以提高工藝產(chǎn)量。
封裝 mRNA
RNA 對到處存在的核糖核酸酶的快速降解高度敏感，這就需要一個有效的系統(tǒng)，不僅可以穩(wěn)定 mRNA，還可以將 mRNA 引入細胞。 mRNA 與遞送系統(tǒng)的混合、以及各種脂質聚合物成分的選擇組合，已被證明可以保護 mRNA 免受核糖核酸酶降解，增強細胞攝取，并改善在靶細胞中的 mRNA 翻譯。
脂質納米顆粒 (LNP) 是最常用的 mRNA 遞送系統(tǒng)；其通常由4種不同的脂質成分組成，包括可電離陽離子脂質、輔助融合磷脂、膽固醇以及聚乙二醇（PEG）-脂質。將mRNA 封裝在脂質復合物中，可使其免受核糖核酸酶降解，同時將其有效地遞送到細胞的細胞質中。
LNP 制備的第一個步驟是將脂質溶解在溶劑（例如乙醇）中，然后使用錯流或微流體混合器將溶解的脂質與含有mRNA 的低 pH 值水性緩沖液快速混合，以獲得包封mRNA的LNP，對混合流道、速度等的優(yōu)化控制是獲得所需粒徑大小、粒徑分布以及包封效率等特性的關鍵。對產(chǎn)生的 mRNA-LNP 復合物進行洗濾，以用中性緩沖液代替低 pH 緩沖液。此步驟應快速進行，以避免在低 pH 值下觀察到的脂質降解。然后通過超濾方法進行濃縮。
LNP 的缺點包括它們可能需要冷鏈物流。此外，鑒于LNP的粒徑，并不總是可以對其進行除菌過濾，在這種情況下，必須考慮替代方案，例如采用完全一次性的封閉式工藝。
暫無
留言框-
